CRISPR/Cas

CRISPR/Cas ist eine molekulare Methode, um DNA an ganz gezielten Stellen zu schneiden. Dadurch können Gene verändert, entfernt oder eingefügt werden.

Allgemein

Es gibt verschiedene Methoden ein Gen zu untersuchen:

• Es kann inaktiviert werden - , sodass es weder transkribiert (Umschreiben in RNA) noch in ein funktionsfähiges Protein translatiert (übersetzt) wird
• DNA-Sequenz wird verändert, sodass ein anderes Genprodukt entsteht

Das Hinzufügen, Unterbrechen, Verändern von DNA-Sequenzen wird als Genom-Editing bezeichnet.

Diese Methode ahmt einen natürlichen Mechanismus nach, den manche Bakterien nutzen, um sich selbst vor Angriffen durch Viren zu schützen.

Aufbau

Der CRISPR Genort setzt sich aus drei Teilen zusammen:

• CRISPR-Array
• Leader-Sequenz
• Cas-Gene

CRISPR Array

• Besteht aus sich abwechselnden Spacern und Repeats
• Die Repeat-Sequenzen sind kurze (23-47 Basenpaar lange) DNA-Abschnitte mit palindromische Struktur
• D.h. sie sind von vorne wie von hinten gelesen gleich (z.B. Anna)
• Spacer sind gleich lange Abschnitte, die die Repeats unterbrechen
• Die Spacer stammen aus dem Erbgut der Viren, die in die Bakterien eingedrungen sind.

Während sich die Spacer unterscheiden, sind die Repeats immer gleich. Daher auch der Name CRISPR, kurz für „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“.

Das beschreibt die kurzen sich wiederholenden Palindrome, die durch die Viren-DNA unterbrochen werden.

Leader Sequenz

Dieser DNA-Abschnitt, enthält verschiedene Basen. Er wirkt als Promotor (Startregion), um das Ablesen des CRISPR-Locus, also dem Genort, zu ermöglichen.

Cas-Gene

Neben den CRISPR-Genen sind die Cas-Gene eine weitere Gruppe von Genen, die notwendig sind, damit das Zerschneiden der DNA funktioniert.

Ihr Name ist die Kurzform für CRISPR-assozierte (Cas) Gene. Diese Gene enthalten die Bauanleitung für bestimmte Enzyme, die für das Virenabwehrsystem wichtig sind. Das sind z.B. Endonukleasen (Zerschneiden DNA-Strang) und Helicasen (Entwinden DNA-Strang).

CRISPR/Cas in Bakterien

In der Natur wird CRISPR/Cas von Bakterien als Abwehrmechanismus gegen Viren verwendet. Viren können nämlich an Bakterien „andocken“ und ihr Erbgut wie mit einer Spritze in die Bakterien injizieren, was für die meisten Bakterien tödlich ist.

Daher nutzen Bakterien CRISPR/Cas-Systeme, um sich zu verteidigen. Das läuft in drei Phasen ab:

• Akquisition - Die Bakterien bauen kurze Abschnitte der Virus-DNA als Spacer in ihr eigenes Genom ein. Das dient ihnen als eine Art „Gedächtnis“.

• Expression - Es erfolgt die Herstellung der Cas-Proteine und der RNA. Sie dient als Vorlage, sodass die Cas-Proteine die Ziel-DNA finden.

• Interferenz - Bei erneutem Eindringen des gleichen Virus, erkennen die Bakterien die fremden DNA-Sequenzen. Dann zerschneiden sie den Strang, um sie unschädlich zu machen.

Funktionsweise

Die einzelnen Bestandteile müssen zusammen arbeiten, um gezielt die fremden DNA-Sequenzen abzubauen. Das läuft folgendermaßen ab:

• Ablesen der CRISPR-Array
• Es entsteht eine lange Vorläufer-RNA, die prä-crRNA (CRISPR RNA)
• Die palindromischen Repeats können darin sogenannte Haarnadelstrukturen (Schleifen) bilden
• Der Strang wird in kürzere Teile geschnitten (crRNAs), die jeweils einen Spacer enthalten
• Beim Typ-II (bestimmte Bakterienklasse) wird dazu außerdem das Protein Cas9, eine tracrRNA (trans-encoded crRNA) und die RNase benötigt

Nur wenn die Pam-Sequenz und die Leader-Sequenz nebeneinander liegen, wird der DNA-Doppelstrang aufgewunden.

• RNA-Moleküle lagern an das komplementäre DNA-Stück an
• Ein Enzym zerschneidet beide Stränge der DNA
• Es entsteht ein Doppelstrangbruch (DNA wird in zwei Einzelstränge geteilt)

Anwendung in der Gentechnik

In der Gentechnik kann die Methode angewandt werden, um ganz gezielt Gene zu verändern.

• Im Labor kann RNA mit jeder gewünschten Zielsequenz und der Cas9-Bindungssequenz hergestellt werden - beliebiges Gen wird inaktiviert
• Herstellung genetisch veränderte Pflanzen
• Abschalten von kranken Genen in der Medizin

Die Technik funktioniert ähnlich wie der natürliche Abwehrmechanismus der Bakterien:

Bei der zufälligen Reparatur werden die Stränge entweder direkt zusammengefügt, sodass ein Stück fehlt oder es werden zufällig neue Basenpaare eingesetzt. In beiden Fällen wird das Gen dadurch inaktiv.

Wusstest du schon?

Die Methode von CRISPR/Cas als Genschere kann erweitert werden:

• In der Gentherapie können Mutanten hergestellt werden, indem einen proteincordierendes Gen eingesetzt wird
• Durch genetische Methoden wurden andere Varianten von Cas9 erzeugt
• Es entsteht kein Doppelstrangbruch mehr
• Die Genexpression wird dadurch gehemmt oder angeregt